Оглавление Перейти на страницу

стр. 92

Полученные нами тетраплоидные растения клевера лугового клеточной линии ТР и Тетраплоидный ВИК 7 показали значительное повышение устойчивости к склеротиниозу по сравнению с исходными растениями диплоидной клеточной линии ВИК 7 (табл. 3).

3. Сравнительное изучение устойчивости к Sclerotinia trifoliorum Eriks. тетраплоидных и диплоидных регенерантов клевера лугового

В исходной клеточной суспензионной культуре среди диплоидов устойчивые к раку генотипы отсутствовали. С переходом на тетраплоидный уровень среди регенерантов клевера лугового без направленной селекции было получено 26 и 16 % устойчивых растений клеточных линий ТР и Тетра ВИК 7 соответственно.

При оценке методом увядания эти растения также показали большую устойчивость к раку. При этом средний балл восприимчивости снизился с 6,2 у диплоидов до 1,6 и 1,35 у тетраплоидов. При этом регенеранты клеточной линии Р-127 составляли группу растений с самыми низкими баллами устойчивости (5 и 7), тогда как четвертая часть регенерантов клеточных линий ТР и Тетра ВИК 7 составляла группу растений с высшим баллом устойчивости (0), более половины — (1) и только 14,3 и 17,8 % соответственно — растения с баллом (3).

Все растения клеточной линии Р-127 к концу опыта по оценке методом увядания погибли, тогда как все регенеранты клеточных линий ТР и Тетра ВИК 7 выжили и после пересадки в вегетационные сосуды с почвой цвели и завязали семена (при искусственном опылении). Спонтанное появление устойчивых растений в процессе культивирования in vitro наблюдалось и у другой клеточной линии — Т-340, полученной из тетраплоидного сорта Tapioi Poli. При этом процент выживших растений после инокуляции их in vitro патогеном (в пробирке) составил 6,0. Однако балл устойчивости этих растений при оценке методом увядания был выше (0,6), чем у регенерантов клеточных линий ТР и Тетра ВИК 7.

Таким образом, культивирование in vitro растений клевера лугового приводило к не индуцированному появлению растений-регенерантов с повышенной устойчивостью к раку.

Клеточная селекция клевера лугового на устойчивость к болезням

Изменения, возникающие на клеточном уровне, но не проявляющиеся у растений-регенерантов в виде видимых изменений, могут быть обнаружены и выделены в процессе культивирования in vitro в селективных условиях, которые создают благоприятные условия для увеличения темпа пролиферации устойчивых клеток.

В качестве селектирующего фактора могут быть использованы непосредственно сам патоген, экстракт патогена, фильтрат культуральной жидкости и частично или полностью очищенный токсин гриба или аналог этого токсина.

Гриб Sclerotinia trifoliorum хорошо растет на питательных средах, используемых нами для культивирования клеточных культур клевера лугового (полная среда В₅ Гамборга с гормональными добавками). При инокуляции агрессивным изолятом культуры патогенна гриб за 4–5 дней распространялся по всей поверхности культуры (каллус, эмбриогенная ткань) и быстро приводил к ее гибели независимо от происхождения клеточной культуры. Поэтому культура гриба для отбора устойчивых генотипов нами не использовалась.

Несмотря на то, что уже во многом известен механизм взаимодействия между патогеном, т. е. грибами рода Sclerotinia spp., в частности, Scl. trifoliorum Еriks. и растением–хозяином Trifolium pratense, до сих пор основной токсин, играющий первостепенную роль в патогенезе, не идентифицирован. В связи с этим для отбора устойчивых генотипов клевера лугового мы использовали культуральный фильтрат (КФ) гриба Scl. trifoliorum.

Избирательность действия КФ на клеточные культуры клевера лугового зависела от его концентрации. При разведении 1 : 400 из 236 клеточных культур, полученных из пяти сортов, не было выявлено ни одной, выдерживающей эту концентрацию, независимо от ее происхождения. При снижении концентрации до 1 : 500 жизнеспособность клеточных популяций значительно варьировала (табл. 4).

4. Влияние культурального фильтрата Scl. trifoliorum Еriks.
на жизнеспособность и эмбриоидогенез клеточных культур клевера лугового

Наименьшее снижение жизнеспособности отмечалось у клеточных линий, полученных из тетраплоидных генотипов. Наименьшую устойчивость к КФ показала диплоидная клеточная линия Р-127. В дальнейших исследованиях ее использовали в качестве тест-объекта для подбора концентрации КФ, обладающего селективным действием. Таковой считали минимальную концентрацию КФ, при которой достигалось снижение жизнеспособности клеток Р-127 до 15–20 %.

Образование эмбриоидов в опытных вариантах, показавших устойчивость к КФ клеточных линий, было достоверно ниже, чем в контрольных вариантах (при Р ≤ 05). В процессе культивирования в среде с КФ отдельные эмбриоиды погибали, другие оставались зелеными и после пересадки на среду для регенерации образовывали морфогенную каллусную ткань, побеги и растения-регенеранты.

Перед высадкой в грунт полученные регенеранты оценивали на устойчивость к патогену Scl. trifoliorum Еriks. Для этого их пересаживали на среду того же состава, но без сахарозы и через трое суток инокулировали патогеном. При этом было установлено, что количество устойчивых растений значительно варьирует (табл. 5).

Предварительная селекция на клеточном уровне повысила частоту устойчивых растений среди регенерантов клеточной линии Т-340 на 85,3 %, ТР на 62,3 %. Тетра ВИК 7 на 52,8 %. Растения, полученные из клеточной линии В-40 сорта Вегонэс, оказались полностью неустойчивыми к патогену. Видимо устойчивость клеточных культур к КФ, из которых они были регенерированы, не была генетически обусловленной, а определялась физиологической адаптацией клеток к селективным условиям.

5. Устойчивость растений-регенерантов клевера лугового к Scl. trifoliorum Еriks.

По-видимому, добавление КФ в среду для культивирования клеточных суспензий создает благоприятные условия для пролиферации и последующей дифференциации клеток и клеточных агрегатов, характеризующихся повышенной устойчивостью к его действию. В результате большое количество эмбриогенных структур, обладающих устойчивостью к КФ, получает преимущества в дальнейшей дифференцировке и, как результат, развиваются в проэмбриоиды, а затем и в интактные устойчивые к патогену растения.

Другая часть клеток, присутствующая до начала культивирования в селективных условиях в большем числе, возможно за счет большой агрегированности используемых клеточных культур и обусловленной этим выносливости к КФ, также частично дает начало растениям-регенерантам без признака устойчивости к патогену.

Таким образом, культивирование в селективных условиях, по-видимому, не приводит к гибели неустойчивые к КФ клетки, а лишь изменяет их количество в культивируемой in vitro популяции.

Регенеранты различались по устойчивости к КФ при оценке методом увядания. Средний балл поражения в опытных и контрольных вариантах у Т-340 составил 0,6 3,2; Тетра ВИК 7 — 1,4 и 3,8; ТР — 1,6 и 4,5. Аналогичные результаты были получены при оценке регенерантов в полевых условиях на искусственном инфекционном фоне. Процент погибших от рака растений-регенерантов на второй год жизни в опытных и контрольных вариантах составил соответственно у Т-340 — 5,0 и 67,5; ТетраВИК 7 — 14,5 и 31,5; ТР — 7,5 и 42,0. Среди регенерантов В-40 и Р-127 устойчивых растений обнаружено не было.

Устойчивость потомства к раку при оценке R₂  значительно варьировала по степени выраженности этого признака (индекс распространенности болезни при искусственном заражении в вегетационном опыте) от 1,0 до 70,3 % в потомстве устойчивых регенерантов при 77,9–83,3 % в контроле (сорт ВИК 7). Лучшие результаты были получены при переопылении растений-регенерантов R₂  3 × 21.1 и 21.1 × 3, в потомстве которых более 80 % растений имели балл поражения 1 в прямой комбинации и 1–3 в обратной. Среди растений R₂ клевера лугового нами были получены семьи, контрастные по признаку устойчивости к раку. У одних, частота растений, выживших после инокуляции патогеном в искусственных условиях, составляла 86,2–96,4, а у других — 2,1–6,8. Всего в искусственных условиях нами было проанализировано 12 семей, из них 3 семьи были высокоустойчивы; 4 — высоковосприимчивы и 5 — занимали промежуточное положение по устойчивости (частота выживших растений составляла 39,4–51,2 %).

Таким образом, результаты исследований по клеточной селекции клевера лугового на устойчивость к раку показали, что культивируемые in vitro клеточные популяции различаются по признаку устойчивости к КФ. Создавая селективные условия, можно отобрать устойчивые к КФ клеточные линии и получить устойчивые к раку растения-регенеранты.

Оглавление Перейти на страницу

стр. 92