Новости

ФГБНУ «ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса»
Приказ ФАНО России от 17.02.2017 № 102 «О реорганизации ...»


< Оглавление
Перейти на страницу
стр. 93 >

Получение форм клевера лугового с повышенной устойчивостью к болезням методом генетической трансформации

 

Как отмечалось ранее, основой получения форм клевера лугового с повышенной устойчивостью к болезням методом клеточной селекции является высокая гетерогенность исходных суспензионных клеточных культур и, как следствие, большая сомаклональная изменчивость по ряду морфологических и физиологических признаков, как в положительную, так и в отрицательную сторону по сравнению с исходным генотипом.

В связи с этим был разработан способ направленного создания методом генетической трансформации форм клевера лугового с одним из целевых признаков (устойчивость к болезням, вредителям и др.) и сохраняющих при этом все ценные селекционные признаки исходного образца.

Для генетической трансформации использовали генотипы клевера лугового сортообразца Ранний 2 с высокой РС и показавшие высокую устойчивость к ионам алюминия при оценке in vitro, в вегетационном и полевом опытах.

В опытах использовали штамм Agrobacterium tumefaciens LGV 3850 и штамм A. rhizogenes А4, содержащие векторные плазмиды pK22ac и pK22rs с маркерным геном npt11 (целевые гены ас-ар и rs-ap —гены синтеза дефензинов амаранта и редьки, повышающие устойчивость к корневым гнилям). Морфогенные культуры, инокулированные агробактериями, помещали на агаризованную среду Гамборга В5 с 2 мг/л БАП и добавлением 50 мг/л канамицина (селективного фактора для отбора клеточных культур клевера лугового с встроенными генами npt11) и 500 мг/л цефотаксима для подавления роста агробактерий. Канамицин добавляли в среды в продолжение всего процесса трансформации и поддержания in vitro коллекции трансформированных морфогенных культур клевера лугового. Субкультивирование на средах с цефотаксимом проводили каждые 3–4 недели, снижая постепенно его концентрацию до 0 мг/л до полной элиминации агробактерий.

Подтверждение наличия генов nptII (маркерный), ac-ap (целевой) в полученных растениях определяли методом ПЦР. При этом очень важным моментом является то, что анализ проводили у растений, выращиваемых на среде Гамборга без добавления клафорана (цефотаксима) при условии отсутствия агробактериальной инфекции, что исключало из анализа нетрансгенные растения, дающие положительный результат по ПЦР за счет остаточной контаминации агробактериями.

В связи с тем, что в исследуемых растениях могут присутствовать собственные гены пептидных антибиотиков, гомологичные введенным трансгенам, для идентификации трансгенных растений методом ПЦР мы использовали праймеры, комплементарные промоторной области 35S вируса мозаики цветной капусты и концевому участку гена ac-ap.

Были проанализированы растения из следующих вариантов опыта:

 

№ 1 LGVac2

№ 2 LGVac15П

№ 3 A4rsI

№ 4 A4rs6

№ 6 A4acI 200

№ 7 A4rs21 I

№ 8 A4rs21 II

№ 9 A4rs6 I

 

№ 10 P8 — контроль, нетрансформированное растение

 

ПЦР-анализ с праймером npt1/npt2 при температуре отжига 50 ºС показал амплификацию всех тестируемых образцов, кроме № 7, с единственным специфичным фрагментом на уровне свечения плазмиды размером 580—590 пар нуклеотидов (рис. 2). В контрольном образце исходного растения (дорожка № 5 на рис. 2) амплификацию не наблюдали.

При ПЦР-анализе исследуемых образцов на наличие целевого гена дефензина амаранта (ac) установлено, что при использовании комбинации праймеров 35S/ac при температуре отжига 52 ºС наблюдали амплификацию образцов, трансформированных штаммом агробактерии с геном дефензина амаранта при отсутствии амплификации в контрольном нетрансгенном растении (рис. 3 — дорожки 6,7,8, образцы LGVac2; LGVac15П; A4acI 200), что свидетельствует о наличие встраиваемых генов в геноме изученных образцов

 

Рис. 2. Результаты ПЦР-анализа растений клевера лугового
с праймерами npt1/npt2 и плазмидой pK22rs (t отжига 50 ºС)
лунки: 1 и 14 — маркер молекулярной массы; 2 — вода, 3 — плазмида pK22rs, 4 — плазмида pK22rs + ДНК исходного образца (контроль — Р8), 5 – контроль Р8; 6–13 — ДНК растений-трансформантов (№ 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9).

1    2  3  4   5   6   7   8   9  10  11  12 13 14

 

Рис. 2. Результаты ПЦР-анализа растений клевера лугового с праймерами npt1/npt2 и плазмидой pK22rs (t отжига 50 ºС)

лунки: 1 и 14 — маркер молекулярной массы; 2 — вода, 3 — плазмида pK22rs, 4 — плазмида pK22rs + ДНК исходного образца (контроль — Р8), 5 – контроль Р8; 6–13 — ДНК растений-трансформантов (№ 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9).

 

Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа с праймерами 35S/ac растений клевера лугового, трансформированных  штаммом, содержащим вектор с геном ac 
(t отжига 52 ºС)
лунки: 1 — маркер молекулярной массы, 2 — вода, 3 — плазмида pK22ac, 4 — pK22ac + ДНК исходного образца (контроль — Р8), 5 — ДНК исходного образца (Р8), 6–8 (№ 1, 2, 6)

1      2     3      4    5     6     7     8

Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа с праймерами 35S/ac растений клевера лугового, трансформированных  штаммом, содержащим вектор с геном ac
(t отжига 52 ºС)

лунки: 1 — маркер молекулярной массы, 2 — вода, 3 — плазмида pK22ac, 4 — pK22ac + ДНК исходного образца (контроль — Р8), 5 — ДНК исходного образца (Р8), 6–8 (№ 1, 2, 6)

Все трансформированные морфогенные культуры клевера лугового сохраняли признак кислотоустойчивости на агаризованной питательной среде Гамборга В5  с 50 мг/л ионов алюминия после длительного (в течение более чем 56 пассажей) культивирования на среде с селективным фактором канамицином. Результаты представлены в таблице 6.

Изученные клоны четырех генотипов клевера лугового сохранили признак устойчивости к А13+ на уровне исходных форм, а клоны трех генотипов A4rs21 I, LGVac15П, LGVac2 даже существенно превышали их по массе образовавшихся корней 72,1, 54,6 и 125 % соответственно. При этом длина корней была больше лишь у двух генотипов (LGVac15П и LGVac2). Существенное превышение массы морфогенной ткани отме чалось у клонов A4rs21 I (на 93,4 %). Средняя масса побегов трансгенных клонов превышала таковую исходных образцов у трех генотипов A4rsК7 11-2, A4rs21I и LGVac15П на 56,9; 38,5 и 32,2 % соответственно.

 

6. Кислотоустойчивость трансгенных морфогенных культур клевера лугового

 

Генотип

Показатели устойчивости к 50 мг/л А13+

Средняя масса, мг/%

Средняя длина, мм/%

побегов

корней

побегов

корней

исход-ных

транс-

генных

исход-ных

транс-

генных

исход-ных

транс-

генных

исход-ных

транс-

генных

A4rsK711-2

41,0

100,0

64,0

156,9

110,0

100,0

120,0

109,9

15,0

100,0

15,0

100,0

90,0

100,0

100,0

111,1

A4rs21 I

26,0

100,0

36,0

138,5

55,0

100,0

95,0

172,1

20,0

100,0

25,0

125,0

70,0

100,0

80,0

114,3

LGVac15П

31,0

100,0

41,0

132,2

55,0

100,0

85,0

154,6

40,0

100,0

50,0

125,0

10,0

100,0

15,0

150,0

LGVac2

64,0

100,0

71,0

110,9

30,0

100,0

75,0

250,0

45,0

100,0

51,0

113,5

50,0

100,0

70,0

140,0

 

Таким образом, полученные данные, и в том числе по способности к ризогенезу изученных клонов на селективной среде, свидетельствуют о сохранении признака кислотоустойчивости растениями-регенерантами в процессе генетической трансформации.

Разработанный способ генетической трансформации растений селекционно-ценных образцов клевера лугового позволил получить растения-регенеранты со встроенными генами — маркерным (канамицинустойчивость) и целевым (ген синтеза дефензина амаранта, повышающего устойчивость растений к корневым гнилям).

Использование для ПЦР-анализа ДНК, выделенной из листовой ткани асептических растений-регенерантов, образовавших корни на среде с 50 мг/л канамицина, позволило выявить трансгенные растения на более ранних этапах культивирования до высадки в почву.

Кроме того, использование при генетической трансформации способа прямой регенерации растений, исключающего возникновение сомаклональной изменчивости, позволило: 1) сохранить селекционно-ценные признаки исходного образца (кислотоустойчивость), 2) поддерживать в культуре in vitro более 50 пассажей трансгенные морфогенные культуры с высокой регенерационной способностью, 3) получить неограниченное количество трансгенных растений-регенерантов.

 

 



< Оглавление
Перейти на страницу
стр. 93 >

 

Контакты:

Тел: +7 (495)577-73-37

Факс: +7(495)577-71-07

E-mail: vniikormov@mail.ru

  

  banner_adaptagro_1

   Архив  журнала  

О ВНИИ кормов

Ведущие ученые ВНИИ кормов  

Услуги ВНИИ кормов (освоение научных разработок) 

Подготовка кадров Аспирантура

Публикации

Патенты

Коммерческие предложения
Продажа семян

Контакты и схема проезда

Центр коллективного пользования (ЦКП)

ФАНО России

Российская Академия Наук

Минсельхоз России

ЦНСХБ

 

Луговое
кормопроизводство

 

Полевое
кормопроизводство

 

Селекция и семеноводство кормовых культур.
Каталог сортов

 

Заготовка кормов