Оглавление Перейти на страницу

стр. 91

МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ В СОЗДАНИИ НОВЫХ СЕЛЕКЦИОННЫХ ИСТОЧНИКОВ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО (КЛЕВЕРА КРАСНОГО)

Л. А. Солодкая, М. Н. Агафодорова, Л. И. Лапотышкина,
И. А. Клименко, Е. Ю. Помазова

Всероссийский научно-исследовательский институт кормов имени
В. Р. Вильямса Российской академии сельскохозяйственных наук, Россия

Биотехнология сегодня — это использование новых экспериментально созданных систем — свободноживущих клеток многоклеточных растений (Бутенко, 1964). Практическую ценность этой новой системы определил ряд ее особенностей. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться в качестве типичного микрообъекта, для их выращивания могут быть использованы контролируемые системы. Даже при очень длительном выращивании in vitro клетки сохраняют основные генетические характеристики исходного растения, а при определенных условиях и тотипотентность, т. е. способность перейти к выполнению программы развития, в результате чего из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к нормальному росту и размножению.

Перечисленные особенности культивируемых клеток растений позволяют создать на их основе различные технологии, которые могут решить некоторые практические задачи, стоящие перед сельским хозяйством. Одна из них — использование методов клеточной и генной инженерии для генетического изменения клеток и полученных на их основе растений-регенерантов.

Селекционные сортообразцы клевера лугового, используемые в качестве исходного материала в клеточных биотехнологиях, представляют собой гетерозиготные, перекрестноопыляемые популяции, состоящие из совокупности генотипов с высокой степенью самостерильности. Они отличаются рядом существенных особенностей, без учета которых невозможно получить положительный результат в работе с культурой клеток и тканей. Это определило специфичность манипуляций на всех этапах регенерации растений от экспланта до генетического анализа полученных растений-регенерантов.

Экспериментально установлено, что число генотипов в сортообразцах кормовых культур, способных к образованию высокоэмбриогенных клеточных линий при первичном введении в культуру in vitro варьирует от 0,1 до 40 %, что значительно сужает генетический потенциал исходного селекционного образца и снижает эффективность последующих селекционных методов (Солодкая, 1987).

В связи с этим в отделе биотехнологии разработано несколько приемов для увеличения выхода дедифференцированных клеточных культур с высокой регенерационной способностью (РС).

Во-первых, среди большого числа генотипов сортообразца на средах, разработанных для модельного сорта ВИК 7, проводят скрининг клеточных линий.

Во-вторых, для отдельных генотипов с хозяйственно ценными признаками экспериментальным путем определяют состав питательных сред, обеспечивающих РС.

В-третьих, способность к регенерации индуцируют путем скрещивания растений без РС с растениями-регенерантами того же образца (Солодкая, 1987). 

В процессе манипуляций, проводимых в течение всего процесса регенерации, в частности при длительном культивировании на средах с высоким содержанием гормонов, возникает сомаклональная изменчивость. В связи с этим для сохранения всех ценных селекционных признаков исходного образца разработаны методы сохранения исходных генотипов.

Переход на новый путь развития — от соматической клетки до целого растения, сопровождается цитогенетической нестабильностью. Включаются ранее не работающие гены, клетки проходят адаптивный период, и популяция начинает приспосабливаться к условиям культивирования in vitro.

Среди растений-регенерантов клевера лугового, полученных из клеток суспензионных культур, наблюдалась большая сомаклональная вариабельность признаков. Подсчет хромосом в пазушных листьях (2–3 мм) 534 регенерантов клевера лугового показал, что 211 растений имели исходный диплоидный набор хромосом (2n = 2х = 14), а остальные были тетраплоидами (2n = 4х = 28). Тетраплоидные растения характеризуются более крупными размерами соцветий, листовых пластинок, более толстыми стеблями. Установлено, что выход полиплоидов среди растений-регенерантов возрастает с увеличением длительности культивирования суспензионных культур. Так, число полиплоидов, полученных из клеточных культур 111-У11 пассажа в среднем варьирует от 0 до 14,6 %, У111-Х11 пассажа — от 20,1 до 66,9 %, Х111-ХУ1 пассажа — более 86,9 %. При регенерации растений из длительно культивируемой клеточной культуры увеличивается выход анеуплоидов. При этом резко снижается выживаемость растений-регенерантов при пересадке их из пробирок в вегетационные сосуды с почвой (табл. 1).

1. Выживаемость растений-регенерантов клевера лугового, полученных из клеточных культур различного возраста

Анеуплоидные растения характеризовались пониженной фертильностью пыльцы, аномальным строением цветков (имели 1–4 пестика, 8–10 тычинок). Часть регенерантов была карликами и имела плохо развитую корневую систему.

Растения-регенеранты отличались от исходных растений по форме куста, длине, окраске и опушенности стеблей, наличию подковообразного пятна на листочках, размеру и количеству их в листе, форме, окраске и величине соцветий, строению и количеству головок в соцветии, продолжительности вегетационного периода.

Характер и количество измененных растений зависело от генотипа исходного растения и его происхождения. Наибольшей вариабельностью характеризовались клеточные культуры, полученные от растений гибридного происхождения (табл. 2).

2. Изменчивость признаков растений-регенерантов клевера лугового,  полученных из клеточных линий различного происхождения

Примечание: а — нежизнеспособных, б — альбиносов, в — многолисточковых, г — многоголовчатых, в — с рассеченным цветком, е — с укороченной цветковой трубкой.

Таким образом, при первичном введении в культуру in vitro наблюдалась сомаклональная изменчивость. Однако при повторном введении в культуру in vitro измененных растений с признаками многолисточковость, рассеченность цветковой трубки, отсутствие пятна на листе были характерны для 100 % растений-регенерантов. Такие же результаты были получены при регенерации растений из эмбриогенной ткани, культивируемой на безгормональных средах.

Первое поколение (Р1) растений, полученное от переопыления исходных форм с растениями-регенерантами, не имеющими видимых изменений по изучаемым сомаклональным признакам, не отличалось от родительских форм. Однако среди растений второго (Р2) поколения наблюдалась большая вариабельность по этим признакам (рис. 1).

Рис. 1. Скрещивание исходного растения и растения-регенеранта клевера лугового (2n = 2х = 14)

Спектр изменчивости сомаклональных признаков растений Р₂, полученных из семян одного соцветия, был идентичен спектру изменчивости растений Р₀, регенерированных из клеток исходной клеточной линии. То есть возникшие в процессе культивирования сомаклональные изменения и не проявившиеся в Р₁ поколении были рецессивными. Генетический анализ показал, что растения Р₂, имеющие признаки альбиносов, многолисточковости и открытый тип цветения, составили примерно четвертую часть всех изученных в Р₂ растений одной семьи. Совпадение фактически и теоретически ожидаемой численности растений по вышеназванным признакам с вероятностью 0,16–0,34 согласовалось с гипотезой, что в Р₂ расщепление по фенотипам происходит в соотношении 3 : 1.

Одним из положительных признаков, наблюдаемых нами среди сомаклональных вариантов, является многолисточковость. Появление многолисточковых сомаклональных вариантов наблюдалось в большом количестве среди тетраплоидных регенерантов клеточных линий Тетра ВИК 7 и ТР (34,1 и 26,8 % соответственно, табл. 2). Значительно меньше их было идентифицировано среди растений клеточной линии Р-127 (4 из 347 растений).

Большой интерес для селекционеров могут представлять сомаклональные варианты клевера лугового, имеющие открытый тип цветка. Этот признак был генетически обусловлен и с вероятностью 0,34 наблюдался в ¹/₄ потомства растений-регенерантов от скрещивания, проведенного по вышеприведенной схеме. Цветок открытого типа имеет такой же длины цветковую трубочку (около 9 мм), что и исходное растение. Однако у него части венчика, образующие лодочку, не сросшиеся, что облегчает их опыление. О мутации цветка клевера лугового с несросшимися лепестками «дельта» сообщал Яблонски (1974), где эта мутация была выявлена среди 10 тысяч растений сорта Глория у единственного растения.

Оглавление Перейти на страницу

стр. 91